Докторские байки

Когда резко понадобилось довести pH карбонатно-бикарбонатного буфера, на помощь приходит простая советская сода из пятерочки.

Стабильный поток для хроматографии без насоса Когда нет насоса, буфер через колонку можно прокачивать самотеком. Нужно налить буфер в емкость, поместить ее над колонкой и соединить трубочкой со входом колонки. Одна проблема: по мере снижения уровня жидкости скорость потока уменьшается, потому что уменьшается гидростатический столб. Но это не проблема - на помощь придет сосуд Мариотта! Сосуд (или сифон) Мариотта - это герметично закрытая емкость с отводом на дне и длинной трубкой, соединенной с атмосферой и опущенной в жидкость. Когда жидкость начинает вытекать из емкости через выход, внутри создается разрежение. Воздух может попасть в систему только через длинную трубку, конец которой находится на определенной глубине в жидкости. Пока уровень жидкости выше конца этой трубки, давление в системе компенсируется таким образом, что гидростатический напор остается постоянным. Этот же принцип используется в некоторых устройствах для автополива растений. Стабильный поток - это воспроизводимое время удерживания и меньшее расплывание зон. А при работе с мягкими сорбентами колба Мариотта позволяет поддерживать постоянное давление без риска сжатия сорбента. Рекомендуется устанавливать трубочку так, чтобы ее конец находился на 2-3 см ниже поверхности жидкости. Если трубка опущена глубоко, скорость потока будет высокой, а если расположена почти у поверхности, вода может быстро вытечь и обнажить кончик трубки - система выйдет из режима постоянного гидростатического напора. Этот ныне почти забытый в хроматографии девайс можно сколхозить самостоятельно. Но раньше были и готовые решения. На фото - колба Мариотта из каталога легендарной фирмы Pharmacia. Причем интересно, что этот девайс два в одном: и упаковочная воронка, и устройство для прокачки при постоянном давлении. Если вам достался упаковочный адаптер Pharmacia, не спешите выбрасывать стеклянную трубку - это очень полезная деталь! Энжойте! Теперь вы знаете, как обеспечивать равномерный поток при хроматографии без электричества и насосов.

Теперь их дозор окончен

Шмерососы для молекулярных биологов Москвы Московские власти решили усилить борьбу со шмерами на агарозных гелях и разработали "шмерососы". Маленькие помощники помогут московским ученым получать чистые гели и добиваться результатов, достойных журналов из белого списка ВАК.

Алкалоиды в лучших аптеках города!

Будь со мной нежен vs да ладно, что ты Обычно при очистке белков ученые вынуждены быть особенно внимательными к условиям очистки для того, чтобы избежать денатурации белков. Очистку проводят при охлаждении, подбирают pH и добавляют стабилизирующие растворы. Но мир белков потрясающе разнообразен - и некоторые белки спокойно выдерживают жесткие условия, которые для большинства их полипептидных собратьев смертельны. Так и в случае адгезивных белков из моллюсков - в статье ученые используют для экстракции разбавленную хлорную кислоту, а для осаждения подкисленный ацетон. И ничего, белок живее всех живых! Этот класс полифенольных белков (mussel adhesive proteins, MAPs) интересный пример природного клея - с помощью них мидии и прочие моллюски способны приклеиваться наже на мокрых поверхностях в море. А все дело в модификациях аминокислот, они богаты катехольными (полифенольными) группами, в первую очередь за счёт аминокислоты DOPA (3,4‑дигидроксифенилаланин). Эти модификации работают на трех уровнях: начальные нековалентные взаимодействия (адгезия), затем окисление до хинона и образование ковалентной сетки, и одновременно формирование металл‑катехольных координационных связей. Теперь вы знаете, как в условиях пост-апокалипсиса получить клей для влажных поверхностей! Вам понадобятся мидии, хлорая кислота, ацетон и солянка. Энжойте!

Актуальный вопрос

Как синтезировать аффинный сорбент. Эпокси активация матрицы Продолжение постов про получение аффинных сорбентов (начало - тут). Эпокси активация сефарозы - это классический способ активации , при котором на поверхности матрицы формируются эпоксигруппы, способные к ковалентному связыванию лигандов. Я активировал эпихлогидрином, простым и доступным эпокси-реагентом. Еще круче - активировать бис-оксиранами (1,4 -бутандиол диглицидиловый эфир), но он дороже. Руслан @Biophyschem рассказывал, что успешно использовал для активации технический 1,4 -бутандиол диглицидиловый эфир купленный на озоне - она используется как разбавитель эпоксидной смолы. После активации на сефарозе появляются эпоксигруппы, которые могут реагировать с аминными, тиольными и гидроксильными группами лигандов, что делает метод универсальным по сравнению с CNBr. Если вы беспокоитесь о токсичности BrCN - эпоксиактивация отличная альтернатива. Преимущества этого метода: 1. Менее токсичные реагенты, по сравнению с BrCN 2. Можно связывать не только по аминогруппам, но и по тиолам и даже гидроксилам (всего-то нужно поменять pH конъюгации) 3. По сравнению с BrCN активацией связь гораздо прочнее, практически отсутствует утечка лиганда. Проще повторно использовать. 4. Связь образуется через гидрофильный спейсер, в случае эпихлоргидрина это три атома углерода, если брать диглицидиловые эфиры -от 6 до 12! 5. Активированный сорбент можно хранить и использовать позднее. 6. Не остается заряженных групп. Недостатки тоже есть: 1. Реакция иммобилизации происходит в щелочных условиях, не всем белкам может подойти 2. Активация проходит дольше 3. По моему опыту - как будто бы емкость получается ниже, чем в случае BrCN 4. Эпокси реагент помимо активациии сорбента может и участвует в кросс-сшивке, с уменьшением пористости микросфер. Для проведения эпоксиактивации я использовал метод, описанный в статье Matsumoto (1979). В замечательной книге Hermanson на стр. 691 также есть протокол (но без DMSO и более долгий). Если кратко - сефарозу ресуспендируют в смеси 0,4M NaOH и DMSO, добавляют эпихлоргидрин и оставляют активироваться на 2 ч при температуре 40С. Потом остается только отмыть, добавить белок в щелочном буфере и проинкубировать. После конъюгации сорбент нужно отмыть и заблокировать оставшиеся эпокси группы и снова отмыть. Неиспользованный активированный сорбент можно хранить в воде с консервантами в холодильнике. Энжойте и получайте аффинный сорбент просто!

Самый первый гель Слюнявчик с гелем - чтобы не облиться буфером!

Не храните долго раствор SDS! Додецильсульфат натрия, или SDS, широко применяется в молекулярной биологии, особенно в электрофорезе в денатурирующих условиях (SDS‑PAGE). Молекула SDS - это производное алифатического спирта (додеканола), в котором гидроксильная группа заменена на сульфатную через эфирную связь. Со временем эта эфирная связь может разрываться. В результате образуются спирт додеканол, который плохо растворим в воде, и серная кислота или сульфат‑ион (в зависимости от pH). Раствор при этом закисляется, может выпасть осадок. В целом SDS при нейтральном pH довольно стабилен, но в кислых или основных условиях и при нагреве распад ускоряется. С сухим порошком, кстати, гидролиз также может происходить - из‑за гигроскопичности сульфатной группы. Эта реакция является автокаталитической: при гидролизе выделяются ионы водорода, которые ускоряют дальнейший гидролиз. Отсюда важные выводы: 1. При сомнениях в свежести проверяйте pH - свежеприготовленный 1% раствор SDS имеет pH ~6.5. Если раствор хранился несколько лет, pH может упасть до 3.5-2.5. 2. Сухой порошок храните герметично закрытым, желательно запарафильмить. Очень старый SDS, с советских времен, перед использованием лучше проверить. Энжойте и следите за своим SDS!